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我国冷冻电镜打破近原子分辨率蛋白结构的最小分子量纪录《资讯》

发布时间:2020-08-17 12:57:13 阅读: 来源:钢纤维厂家

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在国家重点研发计划“蛋白质机器与生命过程调控”重点专项的支持下,清华大学王宏伟教授团队研发利用球差校正器-电压相位板联用冷冻电镜成像系统,大幅度地提升了蛋白质颗粒在照片中的衬度,同时又保存了足够多的高分辨率结构信息用于后期三维重构。在此基础上,利用自主研制的单层大单晶石墨烯载网来冷冻蛋白质样品,使得吸附在亲水化石墨烯表面的蛋白分子免于气液界面造成的分子结构变化,保存了更完整的结构信息。结合两种技术的优势,分别得到了分子量大小为52千道尔顿的链霉亲和素蛋白,以及在结合与未结合小分子生物素两种状态的近原子分辨率结构,创造了利用单颗粒技术解析近原子分辨率蛋白结构的分子量最小值新纪录,拓展了该技术的应用极限。

这一重要研究成果不仅提供了现有单颗粒样品中气液界面对蛋白分子颗粒性质影响的关键证据,对传统理论进行了有力的补充,还为未来方法学的发展起到了积极的推动作用,研究成果2019年6月3日在《自然·通讯》杂志在线发表。

52 kDa链霉亲和素蛋白原始数据及三维重构示意图

冷冻电镜(cryo-EM)单颗粒分析技术已经成为结构生物学众多结构解析方法中异军突起的一支,在膜蛋白的结构解析中更是发挥着与日俱增的作用。目前的冷冻电镜单颗粒技术已经能较容易地将分子量大于300千道尔顿且生化性质稳定的蛋白质解析至近原子分辨率(约3 埃水平)。但由于小分子量蛋白质(一般为小于200千道尔顿)颗粒在冷冻样品中衬度不足等原因,小分子量蛋白质的高分辨解析工作对目前的技术手段而言仍然是很大的挑战。

单粒子冷冻电镜技术为结构生物学带来了新的突破,使其迈入了新纪元。原本难以结晶的目标,其结构也能展现在人类面前,膜蛋白就是这样的例子。在这篇综述中,加州大学旧金山分校的程亦凡教授介绍了冷冻电镜如何协助我们获得了瞬态受体电位(TRP)离子通道的结构。

TRP通道超家族分为7大类,在人类中总共有27个成员,每一个通道都有着特定的生理功能,其中一些也有望成为治疗人类疾病的靶点。但除了这些通道里的少数小型结构域外,人们对这些通道的结晶尝试往往以失败而告终,这也限制了对这些靶点的进一步开发。

2013年,这一困境迎来了终结。当年,《自然》上的两篇论文利用单粒子冷冻电镜技术,获取了TRPV1离子通道位于三种不同状态下的结构,让我们更好地理解了其“感受热量,激活疼痛通路”的作用。TRPV1结构的获得再次强调了冷冻电镜的巨大潜力——当“获取晶体”这一限速步骤被移除后,我们能够以极快的速度获得膜蛋白的原子结构。据统计,在不到5年的时间里,每一类TRP通道,均有至少1个成员的结构得到了解析。

对于大型的动态复合体来说,冷冻电镜更是让原本无法通过结晶获取的结构呈现在了人类面前,剪接体就是极佳的例子。过去,人们要么只能获得其中片段的原子结构,要么只能获得分辨率较低的整体结构。而在单粒子冷冻电镜的协助下,在几年里,我们就获得了剪接体在不同工作状态下的结构,从而拼接出了它工作的完整画面。这在过去是难以想象的。

冷冻电镜领域前所未有的发展速度,也吸引了诸多医药企业的关注。它们期望能够应用这一技术,优化药物的发现过程。

对于大型药企来说,在公司内部的建立冷冻电镜能力是其布局的主要方向——基因泰克在组建内部的冷冻电镜团队;辉瑞斥资500万英镑使用新款的冷冻电镜;诺华通过与Friedrich Miescher研究所的合作也构建了自己的冷冻电镜中心。诺华生物医药研究所(NIBR)的蛋白质科学负责人Christian Wiesmann说,他们的冷冻电镜中心已经初见成效。利用冷冻电镜技术,他们获得了一款蛋白与一种小分子结合时的结构,这能指导药物化学的开发。

对于另一些药企或生物技术公司来说,他们决定组成联盟,共同使用冷冻电镜工具。这一方面是出于成本的考量,但更重要的是,这种联盟能够促进经验的交流。在英国,剑桥医药冷冻电镜联盟(Cambridge Pharmaceutical Cryo-EM Consortium)就是这样的例子——在5家药企的合作下,这一联盟获得了超过300万英镑的资金,于2016年正式启动。

去年5月,该联盟的成员之一阿斯利康发表了一篇论文,揭示了人类突变ATM蛋白的结构。ATM蛋白是一类大型激酶,与DNA的修复有关,在癌症发病中有潜在的作用。而研究人员们获得的结构,其分辨率为4.4?,足以看清其两个构象,其中一个处于“打开”状态,可以结合底物;另一个则处于“关闭”状态。这些发现带来了该蛋白的首个高清结构,也表明它作为分子开关的重要作用。

该联盟的另一个成员Heptares则在探索GPCR的结构。作为一类膜蛋白,它们通常会因为分离过程而失去正常的结构与活性,因此难以通过常规的结晶手段制备样本。但冷冻电镜技术则没有这样的困扰。目前,我们获得的GPCR结构已能让我们看清它们与大型多肽相结合时的结构。它们与小分子结合时的高清结构,会是研究人员们未来的研究方向。

冷冻电镜的未来

冷冻电镜领域在过去40年里发生了重大的改变,而这一技术还有不少可以提高的空间。其中的一大关键在于进一步提高分辨率,达到2?左右,另一大关键在于提高使用的效率。如果我们能够快速获得大批样品的高清结构,无疑将加速这项革命性技术在医药领域的应用。

此外,硬件与软件的升级,也将提升冷冻电镜的能力。更好的光学系统、更好的检测器、更好的算法软件,都能让冷冻电镜在现有的基础上如虎添翼。正如一些业内资深人士指出的那样,要实现这样的功能迭代,让冷冻电镜成为新药发现的常规工具,或许还需要5到10年的时间。但对于诸多医药与生物技术公司而言,目前或许是将这一工具整合至研发系统中的最佳时机。

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